IBU SANTRI
ANALISA DNA
DNA
adalah suatu molekul primer yang keberadaannya selalu terkait dengan RNA dan
protein. Sedangkan dalam menganalisis DNA yang diperlukan adalah DNA dalam
bentuk murni . Karp
(1984) menyatakan bahwa langkah pertama dalam mengekstraksi DNA adalah
menghancurkan sel dan mengisolasi asam nukleat. Dalam ekstraksi DNA jenis
sumber sel yang digunakan ada beberapa macam seperti hati, otot, sirip, darah,
dan sel hasil kultur. Sedangkan kondisi sumber sel meliputi sumber sel segar,
sumber sel terfikasasi dan sumber sel beku w. Pada saat diisolasi, inti sel biasanya
tersuspensi dalam larutan garam buffer, yang kemudian ditambahkan dengan
sedikit larutan deterjen pekat seperti SDS (Sodium Doecyl Sulfat).
Deterjen juga bertindak sebagai penghambat semua aktivitas enzim nuklease yang
ada selama proses ekatraksi. Langkah yang kedua dalam ekstraksi adalah
pemisahan DNA dari bahan-bahan kontaminan seperti RNA dan protein, dimana untuk
menghilangkan protein digunakan proteolitik (Protein
ase
K) pada larutan DNA dan untuk menghilangkan kontaminan RNA digunakan enizm
RNase (ribonuklease)
serta
pengendapan DNA dengan proses sentrifuse, dimana dalam proses
sentrifuse asam nuleat diendapkan dengan
penambahan etanol dingin, dan pellet yang terbentuk dilarutkan kemabila dengan
buffer yang mengandung SDW (Steril Destillation Water) dan pemanenan. Hasil
ekstraksi DNA tersebut merupakan tahapan yang penting untuk prosedur
berikutnya, sehingga ekstraksi DNA harus dilaksanakan dengan baik dan bebas
kontaminansi .Dalam
analisa DNA selanjutnya dilakukan PCR, Menurut Lisdiyanti (1997) prinsip
analisa PCR adalah reaksi memperbanyak DNA dengan memnafaatkan cara replikasi
DNA dengan bantuan enzim DNA polimerase dan perubahan sifat fisik DNA terhadap
suhu. Replikasi DNA terjadi jika DNA utas tunggal yang bertindak sebagai
cetakan, dan ada energi pembangun basa yaitu dNTP, maka enzim DNA polimerase
akan mengatalisis pembuatan DNA utas lain yang merupakan komplemen utas dari
cetakan. Reaksi ini harus dimulai dengan adanya primer atau pemula.
Dalam
proses PCR dilakukan sejumlah siklus yang digunakan untuk mengamplifikasi suatu
sekuen DNA spesifik. Satu siklus terdiri dari tiga tahapan yaitu
denaturasi, annealing (hibridisasi), dan
ekstensi (polimerasi). Denaturasi dilakukan pada suhu 90-95˚C, pada tahap ini
terjadi pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal DNA yang menjadi
cetakan sebagai tempat penempelan primer dan tempat kerja DNA polymerase.
Kemudian dilanjutkan dengan tahap annealing yaitu
tahap pelekatan primer pada masing-masing untaian pita DNA, dengan menggunakan
suhu sedang. Setelah itu pada tahap extention, enzim DNA
polimerase akan bekerja memperpanjang primer hingga terbentuk untaian pasangan
basa pada sepanjang target sekuens DNA. Ketiga tahap ini akan diulang kembali
sampai 25-30 ulangan .
Selanjutnya tahap elektroforesis merupakan
suatu proses migrasi dari fragmen DNA di dalam gel yang direndam dalam larutan
penyangga. Pada pratikum ini primer yang digunakan adalah primer FBPA ( 5΄GAC
AAC GGM TCY GGY 3΄), dan primer RBP 1 (5΄ TAG AAG GTG TGR TGC 3΄).
Metode elektroforesis ini
dapat dikelompokkan menjadi tiga langkah pertama, persiapan gel agarosa dengan
konsentrasi agarose yang disesuaikan dengan ukuran DNA
fragmen yang akan
dipisahkan. Kedua, DNA sampel dimasukkan ke dalam lubang gel dan gel ditaruh di
bak elektroforesis yang dialiri listrik dengan tegangan dan waktu tertentu
sehingga menghasilkan pemisahan yang baik. Pada tahap ketiga, gel direndam
dalam etidium bromida atau etidium bromida telah digunakan pada gel dan penyngga
elektroforesis. Hasil elektroforesis ini dapat dilihat langsung pada penyinaran
dengan sinar UV. Perjalanan DNA ini dipengaruhi oleh arus listrik, The electric
current gived between two electrode causes DNA move from negative pole to
positive pole. Metode Electroporesis / PolymeraseChain Reaction-Temperature
Gradient Gel Electrophoresis (PCR-TGGE) adalah suatu metode analisis keragaman
yang mendeteksi adanya mutasi menggunakan gelyang memiliki perbedaan suhu
(Jasik dan Reichert, 2006). Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)
merupakan salah satu metode
yang dapat membedakan adanya mutasi berdasarkan berat molekul fragmen DNA pada gel yang memiliki perbedaan
konsentrasi bahan untuk menyamakan berat molekul
.
Kesimpulan
DNA merupakan suatu unit
terkecil dari makhluk hidup yang merupakan pembawa sifat keturunan. Analisa DNA
banyak digunakan untuk karakterisasi sifat genetik pada level molekuler yang
secara langsung mencerminkan sifat genotip (materi genetik) yang dimiliki oleh
organisme tertentu. Analisis DNA ini terdiri dari tiga tahap yaitu ekstraksi
DNA, PCR, dan elektroforesis. DNA
terdiri atas dua utas benang polinukleotida yang saling
berpilin membentuk heliks ganda (double helix). Sekarang ini, profil DNA berhasilmemungkinkan untuk
mengaitkan sampel DNA ke orang tertentu dengan tingkat kepastian yang tinggi,
memberikan sesuatu yang baru di bidang penegak hokum, ilmu forensic dan anti
penuaan.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar